Luigi part pour des vacances de rêve avec Mario et ses amis après avoir reçu une invitation dans un hôtel de luxe. Mais son rêve tourne rapidement au cauchemar lorsque King Boo révèle que tout cela n'était qu'un stratagème pour capturer Mario et ses amis. Avec l'aide du professeur E. Gadd, une fois de plus, Luigi, héros réticent et peureux, parcourt de long en large les étages périlleux de cet hôtel désormais sinistre afin de les sauver.